翘首期盼了近4年，终于等到研究成果了。
近日，四川大学华西医院卢铀教授团队在顶级期刊《自然·医学》上发布最新研究成果[1]：使用CRISPR-Cas9编辑的T细胞在临床上治疗疾病是安全可行的。
这项研究成果再次证实了CRISPR基因编辑技术在临床应用中的安全性，为后续类似研究的开展奠定了基础。
▲ 论文首页截图
卢铀教授团队发起的这项基因编辑临床研究，其实是世界第一个CRISPR疗法人体试验，开始于2016年6月。
当时的情况是，大量的基础研究证实，CRISPR-Cas9是一种方便、灵活、精确的基因编辑方法。但是CRISPR-Cas9在临床应用中的安全性还需临床研究检验。
在CRISPR-Cas9基因编辑技术冉冉升起的时候，癌症免疫疗法也在蓬勃发展。阻断PD-1/PD-L1通路的PD-1抑制剂，已经成为PD-L1表达阳性的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的一线治疗药物。这一疗法甚至能将患者的5年生存率提高到15.5%-23%[2]。
免疫疗法的成功，让卢铀教授团队想到：破坏T细胞的PD-1，然后将T细胞回输给患者，对于晚期肺癌的治疗可能也是有效的。
这个猜想一方面是基于免疫治疗的基本逻辑，另一方面是基于当时已经存在的两个基础研究：用锌指编辑技术编辑T细胞的PD-1，可以增强T细胞对黑色素瘤细胞的毒性[3]；以及用CRISPR-Cas9破坏T细胞的PD-1，可在模式小鼠身上对抗胃癌[4]。
T细胞和肿瘤细胞之间的PD-1/PD-L1通路
基于以上的研究成果，卢铀教授团队在晚期肺癌患者中，开展了临床研究。由于是首个人体临床试验，考虑到伦理学问题和脱靶突变的风险，他们在剂量递增的I期临床试验中，只招募那些经过多种疗法治疗之后依然无效的NSCLC患者。
在2016年8月26日到2018年3月21日之间，一共招募了22名患者。研究人员从患者体内采集T细胞，然后用电穿孔的方法将CRISPR-Cas9编辑系统转入T细胞中[5]，破坏PD-1基因的2号外显子。
总体来看，基因编辑的效率在8.7%到31.2%之间，中值是20.1%。在编辑过的T细胞中，PD-1的表达水平明显降低，PD-1的破坏率在33.7%到67%之间，中值是46.3%。
基因编辑T细胞的机制，及编辑效果
在招募的22名患者中，有5名患者因T细胞体外扩增不足，没有接受治疗，余下的17名患者均获得了高活性（90%）的编辑后的T细胞。制备T细胞的中位时间是25天（17-40天）。
只不过，在回输编辑过的T细胞之前，有2人疾病进展，1人肺部感染，1人类风湿关节炎加重，1人主动退出研究。最终有12人接受了T细胞的回输治疗。
接受治疗的患者以28天为一个周期，分三次注射PD-1被编辑过的T细胞，直到患者疾病进展或者出现不能耐受的毒性为止，每位患者每次回输T细胞的中位数是1.33亿个。
试验设计流程
从12位接受治疗的患者来看，他们的T细胞中位编辑效率是5.81%。在所有被编辑的T细胞中。绝大部分是CD3阳性（中值99.1%），CD3和CD8双阳性占比73.5%。
与未被编辑的T细胞相比，在被编辑过的T细胞中，CD8和IFN-γ双阳性的占比显著增加。这表明，破坏T细胞的PD-1之后，T细胞的活性增强了。
至于大家最关心的编辑脱靶率，研究人员也做了深入的研究。总体来看，中位脱靶率是0.05%，远远低于1.69%的中靶率。基于这个数据，研究人员认为，CRISPR-Cas9编辑T细胞是安全的。
具体来看，在主要的脱靶导致的突变中，会导致移码变异的插入/缺失占比71.2%，不会导致移码的插入/缺失占比28.6%，其他类型变异极少。还有一点值得一提的是，这些突变主要出现在基因之间（48.1%）或者内含子（35.1%）区域，对基因功能的影响不大。
脱靶的情况分析
从安全性上来看，在12名接受治疗的患者中，有1名患者没有出现治疗相关不良事件，其余11名患者发生了1/2级与治疗相关的不良事件，例如淋巴细胞减少症（3例）、疲劳（3例）、白细胞减少症（2例）、发烧（2例）、关节痛（2例）和皮疹（2例）。
这就意味着没有患者出现3级及以上的不良事件，而且没有患者出现细胞因子释放综合征。也就是说，CRISPR破坏T细胞的PD-1，作为一种治疗策略是安全的。
治疗相关的副作用
从治疗的效果上看，在长达47.1周的中位随访时间内，12名患者的中位无进展生存期（PFS）是7.7周，中位总生存期（OS）为42.6周。不过没有患者获得部分缓解，只有两名患者病情稳定。
截至2020年1月31日，所有患者出现疾病进展。在12名患者中，有11名（91.7％）死于肿瘤进展，所有患者的死亡均与治疗无关。剩下的一名患者仍在接受其他治疗。
患者的治疗情况
基于以上数据，研究人员认为，他们的研究成果进一步支持了由CRISPR-Cas9技术进行的基因编辑T细胞疗法在临床上的安全性和可行性，这也与Carl June团队近期发表的结果一致[6]。
至于大家担心的脱靶效应，一是脱靶率低，二是绝大多数发生在非编码区，这不太可能对编码基因产生重大影响。
虽然CRISPR-Cas9技术的临床使用的长期安全性仍然需要关注，但是在本研究中，他们发现被编辑的T细胞寿命较短，因此他们认为永久性基因组改变的风险是有限的。
参考文献
[1].https：//www.nature.com/articles/s41591-020-0840-5
[2].Garon E B， Hellmann M D， Rizvi N A， et al. Five-Year Overall Survival for Patients With Advanced Non‒Small-Cell Lung Cancer Treated With Pembrolizumab： Results From the Phase I KEYNOTE-001 Study[J]. Journal of clinical oncology： official journal of the American Society of Clinical Oncology， 2019， 37(28)： 2518-2527.
[3].Beane J D， Lee G， Zheng Z， et al. Clinical scale zinc finger nuclease-mediated gene editing of PD-1 in tumor infiltrating lymphocytes for the treatment of metastatic melanoma[J]. Molecular Therapy， 2015， 23(8)： 1380-1390.
[4].Su S， Zou Z， Chen F， et al. CRISPR-Cas9-mediated disruption of PD-1 on human T cells for adoptive cellular therapies of EBV positive gastric cancer[J]. Oncoimmunology， 2017， 6(1)： e1249558.
[5].Su S， Hu B， Shao J， et al. CRISPR-Cas9 mediated efficient PD-1 disruption on human primary T cells from cancer patients[J]. Scientific reports， 2016， 6： 20070.
[6].Stadtmauer E A， Fraietta J A， Davis M M， et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer[J]. Science， 2020， 367(6481).
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